UJI BATAS MIKROBA - Sharefarmasi.com

UJI BATAS MIKROBA METODE APM ALT KK

Konten [Tampil]

    Uji batas mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba dalam sediaan baik makanan, minuman dan obat-obatan. Uji batas mikroba terdiri atas uji batas jumlah mikroba dan uji batas jenis mikroba patogen. Tujuan pengujian ini adalah untuk menyatakan bahwa sampel tersebut bebas dari mikroorganisme patogen dan batas mikroba tidak melebihi persyaratan yang belaku. Persyaratan yang dimaksud ditetapkan oleh BPOM dan Kementerian Kesehatan RI.

    Uji batas mikroba umumnya dilakukan menggunakan metode angka lempeng total (ALT)/Angka Kapang Kamir) atau metode angka paling mungkin (APM). ALT ditujukan untuk bakteri, sedangkan AKK ditujukan pada pengujian kapang kamir.

Persiapan Uji Batas Mikroba

Homogenisasi 

    Homogenisasi sampel dilakukan untuk mendapatkan distribusi bakteri yang merata dalam sampel yang diperiksa, dengan cara memasukkan sampel ke dalam suatu media cair untuk membebaskan mikroba yang mungkin terlindung dalam molekul-molekul dan meningkatkan kemampuan mikroba yang mungkin turun akibat kondisi sampel.

Prosedur homogenisasi  

• Secara aseptik ambil 10 gram atau 10 ml sampel;
• Masukkan kedalam erlenmeyer yang berisi 90 mL Larutan Dapar Fosfat (LDF).
• Lakukan pencampuran dengan mengocok menggunakan orbital shaker/vortex/manual.

    Apabila didapatkan ternyata terbentuk larutan keruh, maka digunakan metode ALT/AKK, sedangkan apabila sampel masih jernih maka dapat dilakukan metode APM.

Uji Batas Mikroba metode Angka Lempeng Total (ALT) / Angka Kapang Kamir (AKK)

Prosedur Uji Batas Mikroba Bakteri / Angka Lempeng Total (ALT) 

• Buat seri pengenceran  10^-1 sampai 10^-6 menggunakan 1 mL sampel dan 9 mL LDF steril.
• Masukkan kedalam masing-masing seri pengenceran ke dalam petri steril kosong, tambahkan Nutrient Agar sebanyak 15 ml. Biarkan memadat.
• Inkubasikan dalam posisi terbalik pada suhu 35-37^OC selama 24-48 jam.
• Lakukan perhitungan ALT, bandingkan hasil perhitungan dengan ketentuan syarat.

    Contoh perhitungan ALT/AKK dapat dilihat pada : METODE MENGHITUNG MIKROBA

Prosedur Uji Batas Mikroba Kapang dan Kamir / Angka Kapang Kamir (AKK).

• Buat seri pengenceran  10^-1 sampai 10^-6 menggunakan 1 mL sampel dan 9 mL LDF steril.
• Masukkan kedalam masing-masing seri pengenceran ke dalam petri steril kosong, tambahkan Potato Dextrose Agar (PDA) sebanyak 15 ml. Biarkan memadat.
• Inkubasikan dalam posisi terbalik pada suhu 35-37^OC selama 24-48 jam.
• Lakukan perhitungan ALT, bandingkan hasil perhitungan dengan ketentuan syarat. 

Uji Batas Mikroba menggunakan Angka Paling Mungkin (APM/MPN)

Prosedur Uji Batas Mikroba menggunakan Angka Paling Mungkin (APM/MPN)

• Siapkan 12 tabung yang berisi 9 mL media TSA (Tryptone Soy Agar) atau TSB (Trypticase Soy Broth) steril. Bagi menjadi 4 kelompok (masing-masing 3 tabung).
• Kelompok I dimasukkan masing-masing 0,1 ml sampel, kelompok II dimasukkan masing-masing 0,01 ml sampel, dan kelompok III dimasukkan masing-masing 0,001 ml sampel. kelompok 4 dijadikan blangko.
• Inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 20-25^OC.
• Lakukan pengamatan jumlah tabung positif, yaitu tabung yang terjadi pertumbuhan mikroba pada masa inkubasi.
• Kombinasi dari jumlah tabung positif dari setiap kelompok dikonversi menjadi perkiraan nilai mikroba berdasarkan tabel.

    Contoh Perhitungan MPN dapat dilihat pada : METODE MENGHITUNG MIKROBA

Analisis Mikroba Patogen

Analisis cemaran Mikroba Patogen : Escherichia coli

Pengujian Awal cemaran Mikroba Patogen : Escherichia coli

Prosedur :

• Buka kemasan sampel secara aseptik;
• Lakukan homogenisasi dengan cara memasukkan 10 g sampel kedalam 100 mL Lactose Broth (LB) steril;
• Pra-inkubasi dengan cara mendiamkan selama 1 jam pada suhu kamar;
• Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC;
• Media yang telah diinkubasi di lakukan pengocokan menggunakan orbital shaker/vortex/manual hingga homogen;
• Inokulasikan 1 ose sampel pada media selektif Mc Conkey Agar (MCA) dan Eosin Methyl Blue Agar (EMBA) dengan cara gores/streak. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC;

Hasil positif berupa :

• Media MCA : koloni berwarna merah bata, dapat disertai dengan zona endapan empedu;
• Media EMBA : koloni kilap logam.

Uji lanjutan pada mikroba Escherichia coli

    Koloni E.coli kilap logam pada EMBA diinokulasikan lebih lanjut pada media LB steril (beserta tabung durham) dan agar miring NA, kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC. Lanjutkan lagi dengan pengujian IMVIC dan pewarnaan Gram.

Hasil postitif berupa

• Media LB : terdapat pertumbuhan disertai gas pada tabung durham;
• Pewarnaan Gram : basil pendek, Gram negatif;
• IMVIC : Indol (+), Metil Red (+), Voges Proskauer (-), Citrate (-)

Analisis cemaran Mikroba Patogen : Salmonella Sp.

Pengujian Awal cemaran Mikroba Patogen : Salmonella Sp.

Prosedur :

• Buka kemasan sampel secara aseptik;
• Lakukan homogenisasi dengan cara memasukkan 10 g sampel kedalam 100 mL Lactose Broth (LB) steril;
• Pra-inkubasi dengan cara mendiamkan selama 1 jam pada suhu kamar;
• Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC;
• Media yang telah diinkubasi di lakukan pengocokan menggunakan orbital shaker/vortex/manual hingga homogen;
• Pindahkan 1 mL sampel yang telah diinkubasi kedalam masing-masing 10 mL Selenite Cystine Broth dan Tetrathionate Broth. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC. Media yang telah diinkubasi di lakukan pengocokan menggunakan orbital shaker/vortex/manual hingga homogen;
• Inokulasikan 1 ose sampel pada media selektif Brilliant Green Agar (BGA) dengan cara gores/streak. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC; *alternatif  BGA dapat digunakan media Xylosa-Lysine-Desoxycholate Agar (XLDA) dan Bismuth Sulfite Agar (BSA).

Hasil positif berupa :

• Media BGA : Koloni kecil transparan atau merah muda, dapat disertai zona merah muda hingga merah;
• Media XLDA : Koloni merah, dapt diserta pusat berwarna hitam;
• Media BSA : Coklat abu-bau atau hitam kadang disertai kilap metalik. Dapat disertai zona coklat yang semakin lama inkubasi semakin menghitam.

Uji lanjutan pada mikroba Salmonella Sp.

    Koloni diduga  Salmonella Sp. diinokulasikan lebih lanjut dengan cara tusuk dan gores pada media mirin Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA), kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC. 

Hasil positif berupa :

• Media TSIA : lereng (slant) berwarna merah (basa) dan dasar tusukan berwarna kuning (asam), dapat terjadi produksi H₂S berupa endapan hitam;
• Media LIA : lereng (slant) berwarna ungu (basa) dan dasar tusukan berwarna ungu (basa), terjadi produksi H₂S berupa endapan hitam.

Analisis cemaran Mikroba Patogen : Staphylococcus aureus

Pengujian Awal cemaran Mikroba Patogen : Staphylococcus aureus

Prosedur :

• Buka kemasan sampel secara aseptik;
• Lakukan homogenisasi dengan cara memasukkan 10 g sampel kedalam 100 mL media TSB steril;
• Pra-inkubasi dengan cara mendiamkan selama 1 jam pada suhu kamar;
• Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC;
• Media yang telah diinkubasi di lakukan pengocokan menggunakan orbital shaker/vortex/manual hingga homogen;
• Inokulasikan 1 ose sampel pada media selektif Vogel Johnson Agar (VJA). Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC. *alternatif  VJA dapat digunakan media Mannitol Salt Agar (MSA) dan Baird Parker Agar (BPA).

Hasil positif berupa :

• Media VJA : Koloni hitam dengan zona kuning;
• Media MSA : Koloni kuning dengan zona kuning;
• Media BPA : Koloni hitam berkilau, dengan zona jernih 

Uji lanjutan pada mikroba Staphylococcus aureus ( Uji Koagulase )

    Koloni diduga  Staphylococcus aureus pada media VJA diuji koagulase dengan cara memindahkan koloni terduga kedalam 0,5 mL plasma kelinci/plasma kuda, kemudian diinkubasi pada suhu 37^OC. Lakukan pengamatan setiap 3 jam selama 24 jam bersama kontrol negatif.

Hasil positif berupa :

• Pada plasma kelinci atau plasma kuda terjadi koagulasi dalam 24 jam. 

Analisis cemaran Mikroba Patogen : Pseudomonas aeruginosa

Pengujian Awal cemaran Mikroba Patogen : Pseudomonas aeruginosa

Prosedur :

• Buka kemasan sampel secara aseptik;
• Lakukan homogenisasi dengan cara memasukkan 10 g sampel kedalam 100 mL media TSB steril;
• Pra-inkubasi dengan cara mendiamkan selama 1 jam pada suhu kamar;
• Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC;
• Media yang telah diinkubasi di lakukan pengocokan menggunakan orbital shaker/vortex/manual hingga homogen;
• Inokulasikan 1 ose sampel pada media selektif Cetrimide Agar (CetA) dengan cara gores. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35-37^OC. *alternatif  VJA dapat digunakan media Pseudomonas Agar.

Hasil positif berupa :

• Media CetA : Hijau Flourosensi
• Media Pseudomonas Agar Flouresin Detector : Tidak berwarna atau kekuningan dengan fluorosensi kuning.
• Media Pseudomonas Agar Piosianin Detector : Kehijauan dengan fluorosensi biru.

Uji lanjutan pada mikroba Pseudomonas aeruginosa ( Uji Oksidase )

    Koloni diduga  Staphylococcus aureus pada media CetA diuji oksidase dengan cara memindahkan koloni terduga ke kertas saring yang telah dijenuhkan (impregnated) dengan N,N-dimetil-p-fenilendiamin-dihidroklorida (DMPD).

Hasil positif berupa :

• Pada kertas saring yang telah dijenuhkan (impregnated) dengan N,N-dimetil-p-fenilendiamin-dihidroklorida (DMPD) terjadi perubahan warna dari merah muda menjadi lembayung.