METODE MENGHITUNG MIKROBA - Sharefarmasi.com

METODE MENGHITUNG MIKROBA

Konten [Tampil]

    Analisis mikroba secara kuantitatif terkadang diperlukan dalam suatu pengujian, misalnya dalam menentukan batas aman mikroba tertentu pada makanan. Pengukuran jumlah mikroba secara umum dibedakan menjadi pengukuran jumlah sel dan pengukuran massa sel. Pada pengukuran jumlah sel, mikroba yang dihitung berupa organisme sel tunggal, sedangkan pada pengukuran masa sel dilakukan pada mikroba bersel tunggal dan berfilamen (misal : jamur). 

    Satuan dari pengukuran yang dilakukan berdasarkan sampel yang diuji, dengan satuan berupa CFU (Colony Forming unit), yaitu CFU/mL atau CFU/mg.

Metode lempeng total (viable plate count)

    Prinsip dari metode ini adalah penanaman benih kedalam media pada plate/petri, kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Keuntungan metode lempeng total adalah hanya sel hidup saja yang terhitung dan dapat mempermudah isolasi bila diperlukan. Kelemahan metode ini adalah penggunaan peralatan yang cukup banyak (modal), faktor kesalahan yang besar (error), serta waktu yang diperlukan cukup lama.

Prosedur Metode lempeng total :

• Dibuat beberapa seri pengenceran sampel (misal: 0,1 ; 0,01 ; 0,001 ; 0,0001; dst). Semakin banyak seri semakin luas range yang mungkin dicover.
• Inokulasikan sampel pada cawan petri yang berisi media agar dengan cara menyebarkannya dipermukaan (cara sebar/spread).
• Inkubasi selama 16-24 jam pada suhu 35-37 derajat celcius.
• Lakukan pengamatan pada jumlah koloni yang terbentuk. Jumlah koloni dibawah 30 dan diatas 300 koloni tidak dihitung karena dianggap rentan kesalaha secara statistik.

Ketentuan perhitungan  : 

1. Apabila ditemukan hanya 1 dengan range 30-300 maka jumlah tersebut dinyatakan sebagai jumlah. misal : 230 pada pengenceran 0,0001 (sepuluh pangkat minus 5) maka hasil ditulis 2,3 x 0,001 CFU/mL atau CFU/mg.
2. Apabila terdapat beberapa seri pengenceran dengan range 30-300 maka dilakukan perhitungan dengan menggunakan rumus :
3. Apabila tidak satupun yang memenuhi range 30-300, maka :
• < 30 koloni (too few to count/TFTC), ulangi pengujia dengan memperbesar volume sampel;
• > 300 koloni (too numerous to count/ TNTC), ulangi pengujian dengan meningkatkan pengenceran sampel;
• Beberapa pengenceran ulangan tetap < 30 koloni, dianggap < 10 CFU/ml.

Metode langsung 

    Metode langsung (direct count) dilakukan menggunakan prinsip mirip dengan perhitungan pada chamber petroff-hausser (haemositometer), yaitu perhitungan jumlah sel bakteri yang nampak pada chamber khusus dengan pengamatan menggunakan mikroskop. Konsentrasi yang teramati pada chamber kemudian secara keseluruhan dihitung berdasakan asumsi sampel tersebut homogen. Kekurangan metode ini adalah bakteri mati tidak dapat dibedakan, tapi dapat dilakukan dengan cepat karena tidak memerlukan pembiakan/inkubasi.

Metode turbidimetri

    Prinsip metode turbidimetri adalah perhitungan jumlah mikroba berdasarkan konsentrasi dengan menggunakan spektrofotometer atau alat optik lain. Massa sel yang ada dalam sampel sebanding dengan jumlah absorpsi cahaya yang terjadi. Metode ini cepat dan dapat memperkirakan bobot dari mikroba.

Metode Angka Paling Mungkin (APM) / Most Probable Number (MPN)

    Prinsip perhitungan yang didasarkan pada perkiraan secara statistik (probailitas) atas pengujian beberapa seri sampel. metode ini memiliki kerugian berupa tingkat presisi yang lebih rendah dibanding perhitungan secara langsung.

Prosedur pengujian APM/MPN :

• Siapkan 12 tabung yang berisi 9 mL media TSA (Tryptone Soy Agar) steril. Bagi menjadi 4 kelompok (masing-masing 3 tabung).
• Kelompok I dimasukkan masing-masing 0,1 ml sampel, kelompok II dimasukkan masing-masing 0,01 ml sampel, dan kelompok III dimasukkan masing-masing 0,001 ml sampel. kelompok 4 dijadikan blangko.
• Inkubasi selama 16-24 jam pada suhu 35-37 derajat celcius
• Lakukan pengamatan jumlah tabung positif, yaitu tabung yang terjadi pertumbuhan mikroba pada masa inkubasi.
• Kombinasi dari jumlah tabung positif dari setiap kelompok dikonversi menjadi perkiraan nilai mikroba berdasarkan tabel. 

Contoh uji APM/MPN : 

Pada suatu pengujiaan, didapatkan hasil tabung positif yaitu :

• Kelompok I (0,1 mL sampel) didapatkan 3 tabung;
• Kelompok II (0,01 mL sampel) didapatkan 3 tabung;
• Kelompok III (0,001 mL sampel) didapatkan 1 tabung;

Kombinasi yang terjadi adalah 3-3-1, kemudian dilihat pada tabel MPN, maka didapat hasil perkiraan mikroba sebanyak 460 MPN/g. Tabel pengamatan perkiraan dapat dilihat pada tabel MPN dalam farmakope.

Metode kimia

    Metode yang perhitungannya dilakukan secara tidak langsung dan didasarkan pada korelasi metabolit-metabolit yang dihasilkan oleh mikroba dalam sampel. Parameter yang diuji berupa produksi karbon dioksida, konsentrasi protein, metabolisme gula dan lain-lain. Metode ini memerlukan waktu yang cukup lama dan prosedur yang kompleks dalam perhitungannya.

Metode penyaringan / Filtrasi membran

    Perhitungan metode ini ditujukan pada sampel cairan jumlah besar yang memiliki koloni kecil, kisaran koloni adalah 100 CFU/membran. Kekurangan metode ini adalah hanya ditujukan pada sampel cair yang jernih dan waktu yang cukup lama. Setelah sampel disaring dengan saringan normal untuk menghilangkan padatan, sampel diencerkan dengan air steril dan dilakukan homogenisasi, lalu dilanjutkan dengan filtrasi membran. Membran kemudian diinokulasikan kedalam media (petri) untuk dilihat pertumbuhan koloni yang terbentuk.

Metode perhitungan sel elektronik 

    Coulter counter (electronic cell counter) merupakan suatu alat yang secara otomatis dan cepat menghitung jumlah mikroba dalam sampel berdasar sifat konduktivitas mikroba, namun alat ini tidak dapat membedakan sel yang masih hidup dan sudah mati, serta partikel inert yang berada dalam sampel.